Ein Massachusetts General Hospital (MGH) Forscher-team berichtet, dass einige der kürzlich entwickelte CRISPR base-Editoren, die das erstellen gezielte änderungen in einer einzelnen DNA-base, induzieren weit verbreiteten off-target-Effekte in RNA, die sich über die gezielte DNA. Ihren Bericht empfangen, advance online publication in der Natur beschreibt auch engineering-Variante Basis-Editoren, die erheblich reduziert die Häufigkeit der RNA-änderungen und erhöht gleichzeitig die Genauigkeit des auf-Ziel-DNA zu Bearbeiten.
„Die meisten Untersuchung der off-target-base-Bearbeitung hat sich auf die DNA, aber wir haben gefunden, dass diese Technologie setzt große Anzahl von RNA-Veränderungen“, sagt J. Keith Junge, MD, PhD, der MGH-Abteilung der Pathologie und leitender Autor des Nature – Berichts. „Dieser überraschende Befund legt nahe, die Notwendigkeit zu betrachten, mehr als nur eine genetische Veränderung, wenn man bedenkt unbeabsichtigte off-target-Effekte von Basis-Redakteure in den Zellen. Außerdem zeigen wir die Machbarkeit der Reduzierung dieser Effekte durch die Schaffung von Varianten, die selektiv reduzieren off-target-RNA-Bearbeitung unter Beibehaltung der beabsichtigten on-target-DNA-Aktivität.“
Im Gegensatz zu CRISPR-Cas-gene-editing-nukleasen, die mittelbar zielgerichtete Doppelstrang-DNA-Brüche um genetische Veränderungen, CRISPR-base-Editoren sind in der Lage, um die änderung eines einzelnen Nukleotids in einem DNA-Strang ohne eine solche Pausen. Während CRISPR-Cas nukleasen kann verglichen werden mit der Schere, Junge erklärt, base-Editoren können im Vergleich zu einem Bleistift. Fusionsproteine, die mit einer modifizierten form des CRISPR-Cas für die Führung der Ziel-Website, Basis-Editoren verwenden ein Enzym namens eine deaminase zum ändern eines spezifischen Nukleotids, wodurch es zu änderungen führen können, um spezifische DNA-Veränderungen-zum Beispiel, ändern Cytosin in Thymin.
Obwohl die meisten Forscher haben sich auf die DNA-editing-Aktivitäten von Basis-Editoren, die Desaminase in die am häufigsten verwendeten Cytosin-Thymin-editor wurde ursprünglich identifiziert für Ihre Fähigkeit, zu ändern RNA. Dies führte die MGH-team, um zu untersuchen, ob Sie dazu bewegen könnten, die off-target-RNA-Effekte. Ihre Experimente in der Leber und der embryonalen Nieren-Zelllinien zeigten, dass, während die üblicherweise verwendeten Basis-editor für Sie getestet induziert effiziente änderungen an der Ziel-DNA-Website, es führte auch zu Zehntausenden von Cytosin-nach-uracil-Bearbeitungen in der gesamten Transkriptom, das gesamte Spektrum der transkribierten RNA in einer Zelle. Sie fanden ähnliche Ergebnisse, wenn Sie getestet eines der neueren Adenin-targeting-base-Editoren.
Zur Untersuchung der Möglichkeit der Reduzierung oder Eliminierung unerwünschter RNA-Bearbeitungen, das MGH-team abgeschirmt 16 Redaktion mit engineered Versionen der Enzyme deaminase, die Identifizierung von zwei, dass waren so effizient wie die original-version bei der Induktion auf-Ziel-DNA-Effekte während der Induktion deutlich weniger RNA-Bearbeitungen. In der Tat, diese SICHERN (Selektive Bekämpfung Unerwünschter RNA-Editing) – Varianten waren sogar präziser als das unveränderte Desaminase bei der Induktion, die gewünschte DNA-Bearbeitungen.
„Wir waren sehr überrascht, wie viele-zig Tausende-RNA-Bearbeitungen und die Häufigkeit dieser Veränderungen, die wir beobachtet haben, mit der zwei-Klassen der Basis-Editoren“, sagt führen Autor Julian Grünewald, MD, MGH Molekulare Pathologie und der Harvard Medical School. „Wir waren auch froh zu sehen, dass wir erheblich reduzieren die unerwünschten RNA-Bearbeitungen mit unserer SECURE base editor-Varianten.“
Junge stellt fest, dass die Untersuchung der möglichen Auswirkungen dieser RNA-Effekte in der experimentellen und klinischen Anwendungen von CRISPR-Basis-Bearbeitung ist ein wichtiger Nächster Schritt sein team nimmt. „Wir haben gezeigt, dass die weit verbreitete Cytosin-base-editor untersuchten wir eine bescheidene Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen, wenn ausgedrückt in einem menschlichen Zell-Linie, während die SICHEREN Varianten nicht. Für Forschungsanwendungen, die den Wissenschaftler mit base-Editoren müssen-Konto für potenzielle RNA-off-target-Effekte in Ihren Experimenten. Für therapeutische Anwendungen, unsere Ergebnisse weitere Argumente für die Begrenzung der Dauer des Basis-editor expression auf die kürzeste Länge der Zeit, die möglich ist, und die Bedeutung der Minimierung-und Rechnungswesen für die potenziellen Auswirkungen dieser Effekte in safety assessments.“
Ein professor der Pathologie an der Harvard Medical School, der Junge fügt hinzu: „ein Weiterer wichtiger Bereich der Laufenden arbeiten ist die Ausweitung unserer Bemühungen zu minimieren, diese unerwünschte off-target-RNA-Bearbeitungen. Wir sind zurzeit versucht engineer SECURE-Adenin-base-Editoren und die Erkundung der off-target-RNA-Wirkung der Cytosin-base-Editoren verwendet werden, die andere Enzyme deaminase als die, die im editor, die wir untersucht haben. Unser Ziel ist das generieren einer suite von base-Editoren und eine Minimierung der RNA-editing-Aktivitäten, die verwendet werden können für die Forschung und für therapeutische Anwendungen.“
Plasmide Kodieren SICHERE Variante base-Editoren werden von der plasmid-repository Addgene an http://www.addgene.org/crispr-cas.
Weitere co-Autoren von der Natur Papier sind Ronghao Zhou, Sara Garcia, PhD, Sowmya Iyer, PhD, Caleb Lareau und Martin Aryee, PhD, alle von MGH Molekulare Pathologie. Die Studie wurde unterstützt von der Defense Advanced Research Projects Agency Vertrag HR0011-17-2-0042; National Institutes of Health grants RM1 HG009490 und R35 GM118158, und die Desmond und Ann Heathwood MGH Research Scholar Award.