Eine neue CRISPR-gen-editing-Technik verhindert eine genetische Lebererkrankung bekannt zu werden, angetrieben von Hunderten von verschiedenen Mutationen und verbesserte klinische Symptome in den Mäusen, Penn Medicine Forscher berichtet in der neuen proof-of-concept-Studie, veröffentlicht online in der Wissenschaft Fortschritte. Die Ergebnisse deuten auf eine vielversprechende CRISPR-tool, das potenziell die Behandlung von Patienten mit einer seltenen Stoffwechsel-Harnstoff-Zyklus-Störung, verursacht durch einen Mangel des Enzyms Ornithin-transcarbamylase (OTC), sowie andere erbliche Krankheiten, ausgelöst durch verschiedene Mutationen auf demselben gen.
Die CRISPR-Ansatz baut auf einem früheren, entwickelt an der Penn Medizin, die war beschränkt auf die Korrektur nur eine mutation—es profitiert Neugeborene Mäuse, aber nicht für Erwachsene. Diese Zeit, die Technik, die verwendet ein neuartiges, dual-adeno-assoziierten virus (AAV) zu liefern, die seine Komponenten—einfügen „minigene“ in das Genom zu erreichen, eine anhaltende expression von OTC in den Leberzellen, was ist bekannt als „cut“ und „paste“ – Ansatz. Keine Mutationen korrigiert werden können, sondern eine neue Reihe von Anweisungen Hinzugefügt, um die Zellen. Als Ergebnis, Wissenschaftler beobachteten klinischen nutzen in Neugeborenen Mäusen, die nachhaltig bis in das Erwachsenenalter.
„Wie die meisten genetischen Krankheiten, die vorhanden letale Wirkungen bei Neugeborenen, frühe Behandlungen, die wirksam sind für die langfristig unerlässlich sind“, sagte James Wilson, MD, Ph. D., ein professor der Medizin und Direktor des Gen-Therapie-Programm und der Orphan Disease Center an der Penn. „Hier zogen wir ein CRISPR-Ansatz nach vorne, um nicht nur sustain, expression von OTC in den Zellen, sondern erweitern auch das Werkzeug Fähigkeiten. Unser Ziel ist es schließlich übersetzen dieses gen-editing-Ansatz von Tieren, die zur Behandlung von Patienten mit OTC-Erkrankungen und anderen genetischen Krankheiten, die durch Mutationen verteilt über das ganze gen—sondern als eine einzige, vorherrschende mutation.“
Gefunden in fast jeder 40,000 Geburten, OTC-Störung kann stammen aus mehr als 300 verschiedene Mutationen im OTC-gen. Da diese Mutationen auf dem X-Chromosom, ist es in der Regel fanden bei den Männchen, während die Weibchen sind Träger. Die Harnstoff-Zyklus ist eine Reihe von sechs Leber-Enzyme, die helfen, befreien den Körper von Ammoniak. Wenn eines dieser Enzyme fehlt oder mangelhaft ist, Ammoniak Reichert sich im Blut und reist zum Gehirn, die zu Hirnschäden und sogar zum Tod führen. Um die Krankheit zu behandeln, Patienten nehmen Medikamente zu stimulieren, Alternative Stickstoff-clearance Wege, oder in schweren Fällen eine Lebertransplantation. Jedoch Mortalität bei diesen Patienten ist immer noch hoch, somit besteht die Notwendigkeit für neuere, wirksamere Therapien.
Entwicklung einer breit anwendbaren Genom-editing-tool, das team konstruiert eine neue, dual-AAV-Vektor, enthaltend eine RNA-guided Bakterien protein namens Cas9—eine schnelle und zuverlässige Methode zu finden und zu manipulieren Gene in den Zellen. Bekannt als AAV8, dieser Penn-entwickelt vector speziell eine Affinität für die Leber-Zellen. Die zweite AAV enthalten eine voll funktionsfähige „minigene“ Ausdruck einer codon-optimierten menschlichen OTC—Spender-DNA—angetrieben von einem Leber-spezifischen Promotor, um sicherzustellen, es drückt nur in der Leber Zellen, wenn Sie injiziert in das Blut.
Der erste Schritt ist die Erstellung einer Pause in der DNA durch Cas9 bei der Ausrichtung des Website-entlang des Gens (der „Schnitt“), die die Bühne für die Zugabe der minigene in was wird als Homologie gerichtete Reparatur, oder HDR („einfügen“).
„Im Gegensatz zu anderen CRISPR Ansätze, zu löschen oder zu ändern einen Teil des normalen Gens, die diese Technik integriert einen neuen Teil,“ sagte ersten Autor, Lili Wang, Ph. D., research associate professor für Medizin. „Wir versuchen nicht, das zu korrigieren Mutationen, stop-Leber Zellen aus der Produktion von OTC, fügen wir diese neue minigene so können die Zellen.“
Mäuse behandelt mit dem Ziel-Vektor zeigte 25 und 35 Prozent des OTC-exprimierende Zellen in der Leber auf drei und acht Wochen, beziehungsweise—das ist vier – und drei-fache höher als bei den Mäusen behandelt mit der ungezielte Vektor. An beiden Zeitpunkten (drei und acht Wochen), die meisten OTC-positiven Leber-Zellen befanden sich in Clustern verstreut in alle Teile der Leber in der gezielten Mäuse.
Forscher beobachteten auch eine 60-prozentige Reduktion von Ammoniak-Ebenen, die in gezielten Mäuse im Vergleich zu unbehandelten Mäusen gefüttert, die auf einem hohen protein-Diät, einer klinischen Zeichen, die nahelegt, dass die Leberzellen produzieren OTC.